使用ProfiBlot进行过敏源检测的体会

2003-12-26 14:22:06

该文已发表于权威《Allergologie》杂志2002年第4期，第203-208页 AllergyScreen过敏原检测系统和皮试及PHARMACIACAP过敏原检测仪的比较 W．Kersten（德国MOERS环境和医药工业研究院） 概况： 　 过敏原快速检测试验使用多项过敏原混合组合方式，可检测知清中的多项过敏原，方法极为方便。根据试验中过敏原组成的不同，不仅可检测单一致敏原，也可检测某一大类致敏原，并对有可疑过敏史患者使用微量血清确定致敏原意义重大。 　本研究对MEDIWISS公司出品的AllergyScreen过敏原检测系统与皮试和CAP过敏原检测仪进行了比较，结果表时：MEDIWISS检测过敏原的方法可信，快速低价，消耗成本低，非单一过敏原体外试验所能及，敏感度特异性与皮试相似，并与常规单一过敏原体外试验符合。 试验结果： 敏感度：AllergyScreen/皮试:95.1%;AllergyScreen/CAP:84.3%,CAP/皮试:95.8% 特异性：AllergyScreen/皮试:80.2%;AllergyScreen/CAP:95%,CAP/皮试:76.1% 符合率：AllergyScreen/皮试:88.3%;AllergyScreen/CAP:90.6%,CAP/皮试:87.5% 原理和操作步骤： 　　体外特异性的过敏原实验室检测是变态反应性疾病诊断中独立的一部分。与临床检查相比，它的优点是：有更好的敏感性和特异性，结果可靠准确，病人痛苦小，即使在严重的过敏体质患者，也可避免发生意外。多种过敏原筛选检测方法对变态反应疾病的诊断愈显重要。 　　MEDIWISS公司出品的AllergyScreen过敏原检测系统采用免疫印迹方法，定理检测血清中过敏原特异性的IgE。 　　本系统检测原理如下：将用于体外检测的特异性过敏原，固定于硝酸纤维素膜表面，这里使用了新近发展的一种接触性划线系统，该系统不同于许多其它方法的是：其他方法均是将过敏原共价修饰结合于固相物，而本系统中浓缩的过敏原是未经任何修饰地连接到硝酸纤维素膜上。AllergyScreen检测系统中，硝化纤维膜至多可结合20种抗原，由于一次操作即可检测一份样品中的多种抗原，仅需250uL血清，而优于单项过敏原检测系统。 　　实验中，硝化纤维素膜置于一塑料反应槽中，以后的各步操作均在此依次完成，另需一个水平式混合器。首先，加入患者血清，室温下孵育，过敏原特异性的IgE抗体就会与相应的抗原结合并吸附于硝化纤维素膜表面，冲洗，除去未结合的抗体，接着加入生物素标记的抗人IgE抗体，它又与上一步反应中特异性IgE结合，冲洗，除去未结合的抗体；接着再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，再与上步反应中的生特素和阳性对照上的生物素结合，洗脱，最后加入BCIP底物，与碱性磷酸酶发生颜色反应，并在试剂条特异性反应部位上出现沉淀，颜色的深浅与血清标本中的IgE含量成正比。 　　当试剂条完全干燥后，使用数字成像系统和配套软件进行分析。即先用一专用CCD相机进行摄影读取结果，再用专用软件相应原过敏原条带颜色，计算得出的每项一第带的的面积积分再与软件中已存储的标准曲线（药理学中剂量依赖性的对数公式）作对比，得出IgE的浓度，并进行1到6的分级评估。 　　非免疫学反应中的干扰因素均已采用“rolling disc”方法予以考虑排除，此种方法在cut-off分析中也较常采用。 　　测试完毕后，打印出一份包括印迹条带照片，膜的密度曲线，过敏原浓度（IU/ml）和分级的实验报告，患者的数据还可保存备查。 研究： 　　对142名经皮试和/或CAP系统测试确定为呼吸道过敏的患者，使用AlergyScreen系统进行回瞻性研究。皮试以Werner&Ruppert标准为阳性，CAP系统以结果不小于1为阳性。 　　本实验未对AllergyScreen系统中所有的过敏原进行对比研究，而仅对已经皮试和/或CAP系统确定的过敏原进行了比较研究，所以研究中每种过敏原患者标本数量也不相同。 　　对最重要的若干种吸入性过敏原（屋尘螨，粉尘螨，桦树，草粉，艾草，猫，马和狗的毛屑及交链孢霉菌）的敏感度，特异性和准确性进行了统计学分析（AS= AllergyScreen过敏原检测系统，CAP=Pharmacia CAP过敏原检测仪）。 表1：屋尘螨   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 66 1   CAP阴性 61 2   AS阳性 13 14   CAP阳性 10 45                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 76 8   敏感度 97.8 95.7 83.9   特异性 83.5 85.9 98.7 AS阳性 1 47   准确性 88.7 89.8 93.2 表2：粉尘螨   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 63 4   CAP阴性 34 2   AS阳性 12 45   CAP阳性 7 44                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 34 2   敏感度 91.8 95.6 86.5   特异性 84.0 82.9 90.7 AS阳性 7 44   准确性 87.0 89.6 88.4 表3：桦木   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 54 1   CAP阴性 50 2   AS阳性 8 60   CAP阳性 5 61                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 64 8   敏感度 98.3 96.8 88.2   特异性 87.1 90.9 96.9 AS阳性, 2 60   准确性 92.7 94.1 92.5 表4：混合杂草过敏原   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 38 1   CAP阴性 33 2   AS阳性 8 72   CAP阳性 11 66                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 47 7   敏感度 98.6 97.0 91.1   特异性 82.5 75.0 88.7 AS阳性 6 72   准确性 92.4 88.4 90.1 表5：艾草   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 46 3   CAP阴性 22 0   AS阳性 10 23   CAP阳性 8 15                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 53 1   敏感度 88.5 100.0 94.4   特异性 82.1 73.3 94.6 AS阳性 3 17   准确性 84.1 82.2 94.6 表6：猫毛屑   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 8 1   CAP阴性 6 1   AS阳性 8 21   CAP阳性 5 22                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 77 8   敏感度 95.4 95.6 74.2   特异性 50.0 54.5 98.7 AS阳性 1 23   准确性 76.3 82.3 91.7 表7：马皮屑   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 7 0   CAP阴性 3 1   AS阳性 2 16   CAP阳性 3 13                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 28 5   敏感度 100.0 92.8 73.7   特异性 77.8 50.0 97.5 AS阳性 4 14   准确性 92.0 80.0 82.3 表8：狗毛屑   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 15 1   CAP阴性 12 2   AS阳性 4 17   CAP阳性 3 17                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 68 8   敏感度 94.4 89.5 73.3   特异性 78.9 80.0 89.5 AS阳性 8 22   准确性 86.5 85.3 84.9 表9：交链孢霉菌   皮试阴性 皮试阳性     皮试阴性 皮试阳性   AS阴性 52 1   CAP阴性 13 0   AS阳性 2 10   CAP阳性 1 10                     CAP阴性 CAP阴性     皮试-AS 皮试-CAP AS-CAP AS阴性 33 1   敏感度 90.9 100.0 93.3   特异性 96.3 92.8 100.0 AS阳性 0 14   准确性 95.4 95.8 97.9 讨论： 　　使用AllergyScreen系统，以皮试和CAP为对照，对142名过敏性患者进行了回瞻必研究。 　　本研究未包括一些较少见的过敏原，如：豚鼠，野兔，仓鼠和霉菌，因为已有的数据太少而无法进行统计学分析。动物毛屑过敏也仅有少量的阴性标本，因为在日常诊断中，仅当怀疑有既往史的患者才进行该项检测。 　　本研究进行了737份皮试和AllergyScreen，592份皮试和CAP，881份CAP和AllergyScreen结果对比工作。 　　研究表明，AllergyScreen系统有着极好的敏感度，在动物毛屑的比较研究中，AllergyScreen与皮试对比的结果，某种程度上甚至要优于CAP系统，这主要是因为本系统中过敏原是未经任何修饰（如同皮试实验），而非共价结合于硝酸纤维素膜上，并且该系统还使用了生物素—亲和素放大系统使得即使极微量的IgE亦可被检测。 表10：敏感度   皮试—AS 皮试—CAP CAP—AS 屋尘螨 97.8 95.7 83.9 粉尘螨 91.8 95.6 76.5 桦木 98.3 96.8 88.2 混合杂草 98.6 97 91.1 艾草 88.5 100 94.4 猫毛屑 95.4 95.6 74.2 马毛屑 100 92.8 73.7 狗毛屑 94.4 89.5 73.3 交链孢霉菌 90.9 100 93.3 平均值 95.1 95.8 84.3 　　关于特异性，结果显示，AllergyScreen和CAP两系统的特异性类似，但与皮试相比，敏感度略低。尤其在猫的皮屑检测中出现了一定的“假”阳性，二系统间却有着很好的符合率，这是因为二系统特异性更高，而皮试敏感度较高。类似的情况还见于马的毛屑检测中，这里AllergyScreen比CAP有着更好的符合性。这主要是因为在猫，狗，马和其他一些动物上皮中，有一些共同的蛋白抗原可引起交叉反应，而较CAP相比，AllergyScreen更容易检测到这些抗原。 表11：特异性   皮试—AS 皮试—CAP CAP—AS 屋尘螨 83.5 85.9 98.7 粉尘螨 84.0 82.9 90.7 桦木 87.1 90.9 96.9 混合杂草 82.6 75.0 88.7 艾草 82.1 73.3 94.6 猫毛屑 50.0 54.5 98.7 马毛屑 77.8 50.0 97.5 狗毛屑 78.9 80.0 89.5 交链孢霉菌 96.3 92.8 100.0 平均值 80.2 76.1 95.0     研究显示，三种不同方法之间有着很好的符合性。在猫的皮屑检测中，CAP与皮试的相符性略好，而马的皮屑检测中，较之CAP，AllergyScreen与皮试有着很好的符合性，符合率高达88%。 表12：准确性   皮试—AS 皮试—CAP CAP—AS 屋尘螨 88.7 89.9 93.2 粉尘螨 87.0 89.6 88.4 桦木 92.7 94.1 92.5 混合杂草 92.4 88.4 90.1 艾草 84.1 82.2 94.6 猫毛屑 76.3 82.3 91.7 马毛屑 92.0 80.0 82.3 狗毛屑 86.5 85.3 84.6 交链孢霉菌 95.4 95.8 97.9 平均值 88.3 87.5 90.6     应用一专用CCD相机进行快速分析的AllergyScreen系统是一技术先进，具有创意的过敏原定量检测系统，它将科研用途的免疫印迹技术用于了实验室日常诊断。使用针对不同疾患的抗原的特殊组合，可进行众多疾病抗体的筛选检测。 　　需要指出的是：所有体外检测血液中特异性抗体的实验室方法，仅表示该个体处于致敏状态，而不足以得出该个体患有过敏性疾病并应进行相关冶疗。