ABO血型反定型梯形微板法的建立与研究

孙立平  韩璐  陈红 （武汉血液中心430030）

经典的试管离心方法目前仍被认为是最可信赖的ABO定型方法^〔1〕。但是，不适合血站系统大批量的结果处理，不仅费时，而且易出现人为因素所致的差错事故。从上世纪60年代WEGMANN、SMITHIES和CRANTORD等人对血型微量化检测的研究开始^{〔2〕〔3〕}，血型自动化分析形成了两种技术，既卡式凝胶柱法和梯形微板法^〔4〕。而梯形微板法更适合于血站系统的大批量标本的结果处理。该技术利用孔壁呈阶梯状的特殊V字型微孔板（10×12孔），阶梯级宽相当于一个红细胞的直径，级高大于一个红细胞的直径。当相应的抗原（血球）、抗体（血清）发生凝集反应时，彼此粘粘挂在阶梯上，均匀分布于孔壁，未发生抗原抗体反应的红细胞沿阶梯滚落于孔底中央，形成实心圆点。再运用数码成像技术和电脑数据处理系统判断血型。日本 Olympuse 公司运用此技术研制的全自动血型检测仪，于80年代问世，虽然设备技术先进，但其价格十分昂贵，近年在我国仅有两家血站在使用，目前难以在我国各血站普及。我室利用现有的设备资源TECAN RSP-200全自动加样仪，采用深圳爱康公司提供的POSEIDON 数字血型仪和梯形微板整合了一套新的血型检测系统，其核心技术等同于Olympuse全自动血型仪，经济可行。梯形微板法不仅能够完成ABO正反定型实验，其主要优势体现在提高对弱凝集标本的检测灵敏度，因此，常常在正反定型中发现不一致结果，以此对其进一步鉴定来确定血型。笔者主要就血型反定型梯形微板法的建立以及相关试验与U型微板法进行的比较报告如下：

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1  2004年12月至2005年3月本中心无偿献血抗凝全血标本25554人份。

1.1.2  标准红细胞悬液由本实验室自配。采用1-2天内的已知A、B型的新鲜标本各5人份配置。生理盐水市售。

1.1.3  RSP-200全自动加样仪（瑞士TECAN）。AK03A型数字血型分析仪（深圳爱康），XK96型微量振荡器( 国产)，梯形微孔反应板（日本Olympus）。

1.2 方法

1.2.1  实验最佳条件选择  本实验对标准红细胞浓度、血浆稀释度，反应静置时间和反应环境温度4个因素根据正交原理进行了最佳条件的选择。分别选用32个普通A、B、O、AB型标本、9份ABO亚型标本包括（A_M、A_X、A₂B、A₃B、A_XB、AB_X、B_M）七个类型、和6份含不规则抗体标本包括（M、MP₂、NP₂、M^-N⁺P₂）四个类型，经18种条件3次重复实验，确定反应最佳条件为标准红细胞悬液浓度1.8%；血浆稀释度1：1；静置温度20-25℃；静置时间60分钟。

1.2.2  凝集反应与非凝集反应参数的设定  将10份O型标本混合，倍比稀释至1：512梯度，选用以试管法凝集度确定为“+”、“±”的稀释管按照1.2确定的实验条件做梯形微板实验，调整确定临界值，以试管法凝集度为“+”、“±”的稀释管结果均判为灰区的取值为临界值参数：阳性（凝集）临界值为46，阴性（非凝集）临界值为62，低于此参数的结果均判读为该状态灰区。

1.2.3  实验步骤  将每份待检标本血浆在梯形微板上加注2孔，每孔25ul,于普通微板振荡仪振荡至混均（＜30秒），静置60分钟，POSEIDON数字血型仪自动分析反应图象，判读出血型结果，反应结果以数码成像贮存于硬盘中。

2 结果

2.1准确性： 25554例标本按照1.2方法实验，除一例冷凝集、一例亚型和一例溶血标本判读灰区结果外，其余全部一次判读出结果，一次判读正确率为99.99%，高于国内报导U型微板法99.8%^{〔5〕〔6〕}，我室的99.92%。实验结果见表1

表1   两种微板法血型反定型试验结果的比较

2.2 灵敏度 取A、B型血浆各30人份混合，倍比稀释至1：256稀释梯度，分别与试管法和U型微板法进行灵敏度比较试验，结果见表2

 表2      三种实验方法灵敏度比较

^*A细胞： Tc＞21%为凝集反应，Tc＜6%为非凝集反应，6%＜Tc＜21%为灰区

^**B细胞：Tc＞17%为凝集反应，Tc＜6%为非凝集反应，6%＜Tc＜17%为灰区

2.3 重复性：取普通A、B、O、AB型标本各12份，每次间隔一周，用梯形微板法重复3次实验，符合率100%；选取梯形微板实验反应灰区标本10份，连续3次重复实验，10份标本均判读为灰区，符合率100%。

2.4 脂血干扰实验：取各种浓度脂血标本47份，分别进行梯形微板与U型微板法实验，梯形微板法一次判读正确率100%；U型微板法一次判读灰区率14.89%（7/47），错判率6.38%（3/47）。

2.5 溶血干扰实验：将O型血球置-20℃冰箱中使之完全溶血，形成血红蛋白液，分别用O型和AB型血浆与血红蛋白液混合配置成各种浓度血红蛋白的O型和AB型血浆，测得血浆内血红蛋白含量分别为3 g/L、5 g/L、7 g/L、12 g/L、20 g/L、36 g/L、67 g/L和125 g/L，其中含量为7 g/L血红蛋白血浆肉眼可见明显溶血，含量为12 g/L中度溶血、含量为20 g/L以上重度溶血。分别于各浓度O型血红蛋白血浆和AB型血红蛋白血浆内加注A型和B型血球，观察凝集与非凝集反应现象。结果见表3：

表3 溶血标本对两种微板法的干扰比较

3 讨论

POSEIDON数字血型分析软件将梯形微板法的实验结果采用CCD系统图像数字化处理，将每个微孔分解为6300点，划分为3个不同的区域进行扫描，运用模糊数学的方法进行分析判断，得出血型鉴定结果。比运用酶标仪仅在微孔直径一个方向上读取30个值，再计算相对透光率判断血型结果的判读方式更为完善准确。表₁显示梯形微板法一次判读正确率高于我室U型微板法0.07%，25554份标本无1例错误判读。该方法操作分为加样、混匀、静置和判读四个步骤，混匀之后在反应过程中不再振荡，使抗原抗体的结合、凝集与非凝集反应的区分在静置过程中一步完成，避免了在U型微板法第二步振荡过程中对弱凝集状态的破坏，提高了对弱凝集标本的检出率，进而提高实验的灵敏度和准确性。从表₂可见梯形微板法的抗A端凝集效价高于U型微板法2个稀释梯度，抗B端高于U型微板法1个稀释梯度。虽然梯形微板法抗A、抗B端凝集效价均低于试管法2个稀释梯度，但显示灰区反应状态，不会造成漏检。梯形微板法要对标本血浆进行1∶1稀释，从而使脂血对判读的影响大大减弱，47例脂血标本一次判读正确率100%，而U型微板法一次判读灰区率14.89%（7/47），错判率6.38%（3/47），对脂血的抗干扰能力明显优于U型微板法。由于溶血标本使血浆透光率下降，所以对两种方法的结果判读都产生了不同程度的影响。严重的溶血现象（Hb含量为20g/L以上）非凝集端对梯形微板法的影响明显，而对梯形微板法的凝集端和U型微板法非凝集侧均无影响。说明梯形微板法抗溶血干扰能力较U型微板法弱。因此，要求标本新鲜无严重溶血。梯形微板的特殊结构要求对微板的处理最好在超声环境下浸泡后再干燥，读板时要保持微板底部洁净，不能有划痕和污渍。

参     考     文     献

1  高峰主编.输血与输血技术.人民卫生出版社.2003：90

2         Wegmann TG & Smithes O.Improvement of the microtiter hemagglutination method 1968;8:47

3        Crawford,et al.Microplate system for routine use in blood bank  laboratories.Transfusion 1970;10:253

4        Sadayoshi Sekiyuch,Toshiaki Kato.Jap J Chin Exp Med.1989:66(2):360

5        葛红卫等.ABO血型自动化检测方法的建立.中国输血杂志,1998,11(2):63

6        夏卫等.ABO血型全自动微板检测法可靠性探讨.中国输血杂志,2000,13(3):166